KP-3導(dǎo)管癌細胞

注意事項如下:

1 收到細胞后首先觀察T-25瓶是否有損壞、漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2 對于貼壁細胞，若細胞漂浮:培養(yǎng)瓶不開封，用75%酒精擦拭后平躺置于培養(yǎng)箱內(nèi)。次日觀察，如細胞大部分又貼回瓶底，表明細胞活力正常，剩余漂浮的細胞可以去掉;如細胞還不貼壁，將細胞離心收集移到新的培養(yǎng)瓶中，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察，我們的技術(shù)人員會一直跟蹤指導(dǎo)，直到問題解決。

3 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和本公司技術(shù)部溝通交流。

素爾細胞庫提供遺傳變異細胞系、正常組織來源細胞系、腫瘤細胞系、工程細胞系、干細胞系，涉及人類，大鼠、小鼠、鳥類、倉鼠、魚類、貓類、狗、牛、貂、豬、恒河猴、長鼻袋鼠等。

第三節(jié) 天然細胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。

一、血清(serum)細胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應(yīng)用中牛血清又是較為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證血清質(zhì)量也是促進生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。

1、血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因:來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長時間的應(yīng)用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。

2、血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質(zhì)對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進展，但仍存在一些問題。主要是:

*:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難;

第二:血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續(xù)性受到限制;

第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。

3、血清主要作用:

提供基本營養(yǎng)物質(zhì):氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質(zhì)。

提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

提供結(jié)合蛋白:結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用:有一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO₃,硒等。

4、細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點

血清成分復(fù)雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點:

對大多數(shù)細胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞)。

血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(yīng)(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。

動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持*。

取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實驗失敗或?qū)嶒灲Y(jié)果不可靠性。

血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標準化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。

大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成動物細胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

5、血清的質(zhì)量標準:血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素:一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應(yīng)健康無病并且在的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過程應(yīng)嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過嚴格的質(zhì)量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求:

牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。

對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質(zhì)含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內(nèi)毒素，支持細胞增殖檢查。

血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個方面:

理化性質(zhì):如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量(不低于35-45g/L)、球蛋白含量(應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。

微生物檢測:包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結(jié)果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。

KP-3導(dǎo)管癌細胞

促生長效果:這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細胞來檢測。有兩種方法:克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

(1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時間，統(tǒng)計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細微差別。

(2)貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養(yǎng)對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計集落數(shù)，計算出集落數(shù)占接種細胞數(shù)的百分比，同樣再與標準血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。

(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細胞培養(yǎng)于3個一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5%濃度，一般于第七天收集細胞，計數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況，并將每次的計數(shù)結(jié)果與標準血清的測試結(jié)果比較。

對于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性;若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象;如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細胞，觀察細胞生長狀況。

6、血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用。

使用前處理:大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細胞培養(yǎng)。

儲存條件:血清一般儲存于-20℃，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于-20℃，使用前融化。融化時現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應(yīng)盡快使用。

使用濃度:自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5-20%，較常用是10%。過多血清容易使培養(yǎng)中的細胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 采購血清時,先從供應(yīng)商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過預(yù)先試驗的樣品代替。

二、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動物細胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。

三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細胞和原代細胞的培養(yǎng)。